Cromatografía (HPLC / GC) — Ecuaciones de MatLens

Procesado de cromatogramas, idoneidad del sistema y cuantificación en matlens/chroma/. Los tiempos están en las unidades de la columna X (normalmente min). La vista de cromatografía (matlens/ui/chroma_ui.py) calcula todas sus tablas con estas funciones.

Línea base, picos e integración

Código: matlens/chroma/processing.py::baseline, matlens/chroma/processing.py::detect_peaks, matlens/chroma/processing.py::integrate

Línea base: mínimo móvil con ventana $w = \max(21, N/5)$ puntos (impar), suavizado después con Savitzky–Golay de orden 2. Señal neta $y_n = \max(y - b, 0)$ . Picos con prominencia $\ge 0.02\max y_n$ (por defecto); límites donde $y_n$ cae por debajo del 2 % de la altura, y los picos solapados se separan en el mínimo entre ápices.

Modos de integración (trapezoidal entre los límites $t_s$ , $t_e$ del pico):

A_\text{caída} = \int_{t_s}^{t_e} y_n\,dt,\qquad A_\text{valle} = \int_{t_s}^{t_e} \max\big(y - \ell_v(t), 0\big)\,dt,\qquad A_\text{tang} = \int_{t_s}^{t_*} \max\big(y - \ell_t(t), 0\big)\,dt

caída perpendicular: área sobre la línea base estimada, con cortes verticales en los valles;
valle a valle: $\ell_v$ es la recta que une la señal en los dos límites del pico;
tangente (descremado): $\ell_t$ parte del valle delantero con la menor pendiente que deja la señal por encima en el flanco posterior; toca la señal en $t_*$ .

$w_{1/2}$ es la anchura a media altura con los dos cruces interpolados linealmente entre muestras. Anchura en la base de una gaussiana (tangentes en los puntos de inflexión):

w_b = 4\sigma = \frac{4\,w_{1/2}}{2\sqrt{2\ln 2}} = \frac{4\,w_{1/2}}{2.35482\ldots}

Referencia: Dyson, Chromatographic Integration Methods, 2.ª ed. (RSC 1998).

Deconvolución (gaussiana / EMG)

Código: matlens/chroma/processing.py::gaussian, matlens/chroma/processing.py::emg, matlens/chroma/processing.py::deconvolve

G(t) = h\,e^{-(t-\mu)^2/2\sigma^2}

\mathrm{EMG}(t) = h\,\frac{\sigma}{\tau}\,\exp\!\left[\frac{1}{2}\left(\frac{\sigma}{\tau}\right)^2 - \frac{t-\mu}{\tau}\right]\mathrm{erfc}\!\left(-\frac{z}{\sqrt{2}}\right), \qquad z = \frac{t-\mu}{\sigma} - \frac{\sigma}{\tau}

Ajuste lmfit (leastsq, no ponderado) de la suma de componentes a $y_n$ . Inicio: $h$ = señal neta en cada centro dado, $\mu$ = centro ( $\pm$ intervalo/6), $\sigma$ = intervalo/25 ( $[\Delta t, \text{intervalo}/6]$ ), $\tau$ = intervalo/100 ( $\ge \Delta t/10$ ). Áreas informadas (integrales exactas de cada forma):

A_G = h\,\lvert\sigma\rvert\sqrt{2\pi},\qquad A_\text{EMG} = 2\,h\,\lvert\sigma\rvert

ya que $\mathrm{EMG}(t) = 2h\sigma\cdot f(t)$ con $f$ la densidad EMG de área unidad.

Referencia: Grushka, Anal. Chem. 44 (1972) 1733.

Índices de retención (Kovats isotermo y lineal programado)

Código: matlens/chroma/processing.py::kovats, matlens/chroma/processing.py::retention_index_programmed

Isotermo (Kovats), con tiempos ajustados $t' = t_R - t_M$ :

I = 100\left[n + (N-n)\,\frac{\log t'_x - \log t'_n}{\log t'_N - \log t'_n}\right]

Temperatura programada (van den Dool y Kratz), con tiempos brutos:

I = 100\left[n + (N-n)\,\frac{t_x - t_n}{t_N - t_n}\right]

$n$ y $N$ son los números de carbonos de los n-alcanos que eluyen antes y después. Fuera del intervalo de alcanos se devuelve NaN; kovats exige el tiempo muerto t_m y rechaza tiempos menores o iguales que él. La vista de cromatografía usa el índice programado con la serie de n-alcanos que introduce el usuario; sin serie no muestra ningún índice.

Referencias: Kovats, Helv. Chim. Acta 41 (1958) 1915; van den Dool y Kratz, J. Chromatogr. 11 (1963) 463.

Idoneidad del sistema (USP 621)

Código: matlens/chroma/suitability.py::plate_count, matlens/chroma/suitability.py::resolution, matlens/chroma/suitability.py::tailing_factor, matlens/chroma/suitability.py::capacity_factor, matlens/chroma/suitability.py::repeatability_rsd, matlens/chroma/suitability.py::suitability_report

N = 5.54\left(\frac{t_R}{w_{1/2}}\right)^2, \qquad R_s = \frac{2\,(t_{R,2}-t_{R,1})}{w_1 + w_2}

T_f = \frac{a + b}{2a}\;\;(\text{al 5 \% de la altura}), \qquad k' = \frac{t_R - t_0}{t_0}, \qquad \mathrm{RSD} = 100\,\frac{s}{\bar A}

Símbolo	Significado	Unidades
$t_R$ , $t_0$	tiempo de retención y tiempo muerto	min
$w_{1/2}$	anchura a media altura	min
$w_1$ , $w_2$	anchuras en la base $w_b = 4w_{1/2}/(2\sqrt{2\ln2})$ (o $w_{1/2}$ si $w_b = 0$ )	min
$a$ , $b$	semianchuras delantera y trasera al 5 % de la altura, medidas desde el ápice	min
$\bar A$ , $s$	media y desviación estándar muestral ( $n-1$ ) de las áreas de inyecciones replicadas	unidades de área

Criterios por defecto: $R_s \ge 1.5$ , $T_f \le 2.0$ , $N \ge 2000$ y RSD $\le 2.0\,\%$ (valor de USP 621 para cinco réplicas). El RSD solo se evalúa si se dan las áreas de inyecciones replicadas; si no, figura como "no evaluado" y no entra en el veredicto.

Nota (diferencia con la literatura): $R_s$ usa la anchura en la base gaussiana $4\sigma$ calculada desde $w_{1/2}$ , no las tangentes trazadas sobre el pico real; para picos con cola ambas difieren.

Referencia: USP 621; Ph. Eur. 2.2.46.

Cuantificación

Código: matlens/chroma/quantify.py::external_standard, matlens/chroma/quantify.py::internal_standard, matlens/chroma/quantify.py::response_factor, matlens/methods/statistics.py::linear_regression, matlens/methods/statistics.py::inverse_prediction

Calibración por mínimos cuadrados (ponderación ninguna, $1/x$ o $1/x^2$ ) e interpolación inversa:

x_0 = \frac{y_0 - b_0}{b_1}, \qquad s_{x_0} = \frac{s_{y/x}}{b_1}\sqrt{\frac{1}{m} + \frac{1}{n} + \frac{(y_0 - \bar{y})^2}{b_1^2\sum w_i (x_i-\bar{x})^2}}, \qquad U = 2\,s_{x_0}

con $m$ = número de inyecciones replicadas promediadas (replicate), $n$ patrones, $\bar{x}$ , $\bar{y}$ medias ponderadas y $s_{y/x}$ la desviación residual ponderada. Con calibración cuadrática se usa la raíz de $b_0 + b_1x + b_2x^2 = y_0$ dentro del intervalo calibrado y

s_{x_0} = \frac{s_{y/x}\sqrt{\mathbf g^\top(\mathbf V^\top\mathbf W\mathbf V)^{-1}\mathbf g + 1/(m\,w_0)}}{\lvert b_1 + 2b_2x_0\rvert},\qquad \mathbf g = (1, x_0, x_0^2)

que para la recta se reduce a la expresión anterior. Estándar interno: se calibra la razón de áreas $A_\text{analito}/A_\text{EI}$ frente a la razón de concentraciones $C_\text{analito}/C_\text{EI}$ ; la razón de áreas de la muestra da su razón de concentraciones y $C_\text{analito} = x_0\,C_\text{EI}$ (amount_is), con $U$ escalada igual. Factor de respuesta de un punto: $RF = A/\text{cantidad}$ .

Referencia: ICH Q2; Miller & Miller, Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, §5; Harris, Quantitative Chemical Analysis, §5-4.

Origen físico y límites de validez

El número de platos procede del modelo de platos teóricos de Martin y Synge: un pico gaussiano de varianza temporal $\sigma_t^2$ cumple $N = (t_R/\sigma_t)^2$ ; con $w_{1/2} = 2\sqrt{2\ln2}\,\sigma_t$ resulta $N = 8\ln2\,(t_R/w_{1/2})^2 = 5.545\,(t_R/w_{1/2})^2$ (USP redondea a 5.54). La resolución compara la separación de ápices con la semisuma de anchuras en la base ( $4\sigma$ ). Ambas expresiones suponen picos gaussianos; con cola (EMG) $N$ y $R_s$ quedan sesgados (véase la Nota anterior). El factor de cola mide la asimetría al 5 % de la altura; vale 1 para un pico simétrico.

La caída perpendicular reparte mal el área entre picos de tamaño muy distinto; el descremado tangencial es preferible para un pico pequeño sobre la cola de uno grande (Dyson 1998). El área es proporcional a la cantidad solo dentro del intervalo lineal del detector.

Algoritmo completo de MatLens

Línea base (baseline): mínimo móvil de ventana $w$ (impar, $\max(21, N/5)$ ) con relleno de borde; Savitzky–Golay de orden 2 con la misma ventana. Si $N \le w$ , la línea base es el mínimo global.
Detección (detect_peaks): scipy.signal.find_peaks sobre la señal neta, prominencia $0.02\max y_n$ , distancia mínima 3 puntos; límites mientras la señal neta supera el 2 % de la altura; los picos solapados se cortan en el mínimo entre ápices.
Integración trapezoidal según el modo; $w_{1/2}$ con interpolación lineal (0 si un cruce cae fuera de la ventana del pico) y $w_b = 4w_{1/2}/2.35482$ .
Idoneidad: $N$ , $T_f$ y $R_s$ se recalculan con caída perpendicular; $k'$ solo si se da $t_0$ ; RSD solo con áreas replicadas. El veredicto exige todos los criterios.
Deconvolución: lmfit.minimize (leastsq), residuo no ponderado sobre la señal neta, con los límites indicados arriba.

Incertidumbre y avisos

Solo la cuantificación propaga incertidumbre: $U = 2\,s_{x_0}$ ( $k = 2$ ), que incluye la dispersión de la calibración y de las $m$ inyecciones de la muestra, pero no la incertidumbre de los patrones, la de la preparación ni el sesgo de integración. Los parámetros de idoneidad, las áreas y los índices de retención se dan sin incertidumbre. matlens/chroma/ no emite indicadores warning/invalid: los criterios fallidos aparecen en el veredicto USP y los casos imposibles (tiempo muerto no menor que $t_R$ , modo desconocido) lanzan un error.

Ejemplo resuelto: idoneidad del sistema

Cromatograma sintético de 10 min (2001 puntos): una gaussiana ( $h = 100$ , $t = 4.0$ min, $\sigma = 0.05$ min, área exacta 12.53) y un pico EMG con cola ( $h = 60$ , $\mu = 4.6$ , $\sigma = 0.05$ , $\tau = 0.04$ min), sobre una línea base constante de 2 con ruido gaussiano $\sigma = 0.2$ (semilla fija); $t_0 = 1.0$ min y cinco áreas replicadas 10.02, 10.11, 9.95, 10.06, 9.98. Detección e integración por caída perpendicular y suitability_report:

Pico	$t_R$ (min)	Área	$w_{1/2}$ (min)	$N$	$T_f$	$k'$
1	4	12.63	0.1184	6322	1	3
2	4.63	6.169	0.139	6149	1.19	3.63

$R_s$ = 2.88; RSD = 0.633 %; veredicto USP 621: cumple.

Ejemplo resuelto: índices de retención

n-Alcanos C10, C11 y C12 a 5.20, 7.85 y 10.40 min; analito a 9.10 min; $t_M = 1.0$ min.

Índice	Valor
programado (van den Dool–Kratz)	1149.02
Kovats isotermo	1152.97